कुशल लघु बाह्यकोशिकीय पुटिका तैयारी के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के साथ संयुक्त टीएफएफ स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन

छोटे बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं (एसईवी) कोशिकाओं द्वारा स्रावित नैनोस्केल पुटिकाएं हैं जिनमें न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, छोटे अणु और अन्य घटक होते हैं, और अंतरकोशिकीय संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एक्सोसोम प्रकार के छोटे बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं अपनी मूल कोशिकाओं के साथ उच्च समानताएं साझा करती हैं। कृत्रिम नैनोकणों की तुलना में, वे कम प्रतिरक्षा निकासी दर और कम साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित करते हैं, जिससे वे नए आशाजनक उम्मीदवार बन जाते हैंविवो दवा वितरण वाहनों में. लगभग सभी प्रकार की कोशिकाएं इन पुटिकाओं का स्राव कर सकती हैं, और दवा वाहक के रूप में उनके अनुप्रयोग पर शोध धीरे-धीरे प्रयोगशाला से नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों की ओर बढ़ रहा है। तथापि,बड़े पैमाने पर उत्पादन एक बड़ी बाधा बनी हुई है.

 

एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल अलगाव के लिए वर्तमान तरीके

वर्तमान बाह्यकोशिकीय पुटिका अलगाव विधियों में शामिल हैंअल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन, आकार -बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), और पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) वर्षा.

पीईजी अवक्षेपण उच्च उपज और सरल संचालन प्रदान करता है, लेकिन यह अवांछित प्रोटीन द्वारा महत्वपूर्ण संदूषण से जुड़ा है। घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन और आकार {{1}बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी उच्च {{2}शुद्धता वाले उत्पाद प्रदान कर सकती है, लेकिन उनकी दक्षता अपेक्षाकृत कम है और प्रक्रियाओं में समय लगता है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन इसकी प्रसंस्करण मात्रा सेंट्रीफ्यूज क्षमता द्वारा सीमित है, जिससे इसे बढ़ाना मुश्किल हो जाता है।

 

एसईवी पृथक्करण के लिए स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन का अनुप्रयोग

लिपोसोम्स और लेंटिवायरल वैक्टर जैसे नैनोकणों को अलग करने के लिए स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) पहले से ही लागू किया जा चुका है। टीएफएफ में, फ़ीड झिल्ली की सतह पर स्पर्शरेखीय रूप से बहती है, जो झिल्ली की गंदगी को कम करने में मदद करती है और प्रक्रिया को बड़े पैमाने पर आसान बनाती है।

चूंकि छोटे बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं आमतौर पर होती हैं30-200 एनएमव्यास में, ए0.45 μm झिल्ली कैसेटबड़े प्रोटीन और पुटिकाओं को हटाने के लिए टीएफएफ प्रणाली में चयन किया जा सकता है, जबकि ए300 केडीए झिल्ली कैसेटइसका उपयोग छोटे आणविक भार प्रोटीन को हटाने और संवर्धन माध्यम में मौजूद छोटे बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं को केंद्रित करने के लिए किया जा सकता है।

 

टीएफएफ पृथक्करण के बाद कच्चे माल की विशेषता

नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) से पता चला कि कण व्यास मुख्य रूप से की सीमा के भीतर वितरित किए गए थे0-250 एनएम.

 

 

हालाँकि, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) से बड़ी मात्रा में दूषित प्रोटीन का पता चला, जबकि कोई बाह्य कोशिकीय पुटिका नहीं देखी गई। इन परिणामों ने संकेत दिया कि बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को और अधिक शुद्ध करने के लिए एक अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण कदम की आवश्यकता थी।

 

100 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन के बाद टीएफएफ कॉन्सेंट्रेट की विशेषता

टीएफएफ सांद्रण को आगे एक का उपयोग करके संसाधित किया गया था100 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब.

एनटीए ने दिखाया कि अल्ट्राफिल्ट्रेशन के एक और दो राउंड के बाद प्राप्त सांद्रण में कण व्यास मुख्य रूप से की सीमा के भीतर रहे0-250 एनएम. हालाँकि, दो बार अल्ट्राफिल्ट्रेशन करने से प्राप्त कणों की संख्या में उल्लेखनीय कमी आई।

टीईएम विश्लेषण से पता चला कि एक या दो बार अल्ट्राफिल्ट्रेशन सांद्रण में कोई पुटिका जैसी संरचनाएं नहीं देखी गईं, जबकि काफी मात्रा में दूषित प्रोटीन बना रहा।

इसलिए,टीएफएफ एकाग्रता के बाद संस्कृति माध्यम को शुद्ध करने के लिए 100 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन का प्रभावी ढंग से उपयोग नहीं किया जा सका.

 

 

अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध किए गए टीएफएफ कॉन्सेंट्रेट की विशेषता

एनटीए ने दिखाया कि शुद्ध उत्पादों के कण व्यास मुख्य रूप से की सीमा के भीतर वितरित किए गए थे0-250 एनएम.

महत्वपूर्ण बात यह है कि टीईएम ने दृश्य के विभिन्न क्षेत्रों में पुटिका जैसी संरचनाओं को स्पष्ट रूप से प्रकट किया। इन परिणामों से पता चला कि टीएफएफ का उपयोग करके संस्कृति माध्यम को केंद्रित करने के बाद,अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन को बाद में बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को और अलग करने और शुद्ध करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

 

 

अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के साथ संयुक्त टीएफएफ का उपयोग करके मेसेनकाइमल स्टेम सेल वातानुकूलित माध्यम से पृथक एसईवी की विशेषता

एनटीए ने दिखाया कि शुद्ध उत्पादों के कण व्यास मुख्य रूप से की सीमा के भीतर वितरित किए गए थे0-250 एनएम.

टीईएम द्वारा पुटिका जैसी संरचनाएं देखी गईं। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने बाह्यकोशिकीय पुटिका से जुड़े प्रोटीन की सकारात्मक अभिव्यक्ति प्रदर्शित कीCD9, CD63, और ALIXशुद्ध बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं में।

इन परिणामों ने पुष्टि की कि शुद्ध छोटे बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं में एक्सोसोम होते हैं, जो दर्शाता है कि इस विधि का उपयोग इसके लिए भी किया जा सकता हैएक्सोसोम अलगाव और निष्कर्षण.

 

 

निष्कर्ष: उच्च गुणवत्ता वाली एसईवी तैयारी के लिए टीएफएफ को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के साथ जोड़ा गया

अध्ययन ने यह प्रदर्शित कियाअकेले टीएफएफ एकाग्रतापरिणामस्वरूप एक उत्पाद में काफी मात्रा में दूषित प्रोटीन मौजूद था और इसलिए यह योग्य बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं को प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त था।

इसी तरह, एक का उपयोग करद्वितीयक शुद्धिकरण के लिए 100 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबप्रभावी रूप से अक्षुण्ण पुटिका संरचनाएं उत्पन्न नहीं हुईं।

टीएफएफ एकाग्रता को बाद के अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन शुद्धि के साथ जोड़कर, दोनों तकनीकों के लाभों को प्राप्त करने के लिए एकीकृत किया जा सकता हैउच्च गुणवत्ता वाले छोटे बाह्यकोशिकीय पुटिका उत्पाद.

अकेले पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में, संयुक्त प्रक्रिया प्रभावी ढंग से हो सकती हैसमग्र प्रसंस्करण समय को कम करें और पृथक्करण दक्षता में सुधार करें.

इस वर्कफ़्लो में,टीएफएफ बड़ी मात्रा में नमूनों को तेजी से समृद्ध करने में सक्षम बनाता है, बड़े नमूना संस्करणों के प्रसंस्करण में पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की सीमा को संबोधित करते हुए। इसके बाद अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, पुटिकाओं की शुद्धता और अखंडता को बनाए रखने में मदद करते हुए सह-केंद्रित प्रोटीन अशुद्धियों को हटाने के लिए गहन शुद्धिकरण करता है।

इसके अलावा, इस प्रक्रिया को जोड़ने की आवश्यकता नहीं हैबहिर्जात रासायनिक अवक्षेपण अभिकर्मक, पुटिकाओं की जैविक गतिविधि को यथासंभव अधिकतम सीमा तक संरक्षित करने में मदद करता है।

औद्योगिक अनुवाद की दृष्टि से यह प्रक्रिया महत्वपूर्ण हैक्षमता को {{0}बढ़ाएंऔर बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन से जुड़ी चुनौतियों का समाधान करने में मदद कर सकता हैदवा वितरण, पुनर्योजी चिकित्सा, और संबंधित उत्पाद विकास. यह बाद की प्रक्रिया अनुकूलन और पायलट स्तर पर विनिर्माण के लिए एक ठोस प्रयोगात्मक आधार भी प्रदान करता है।

 

संदर्भ

वांग लिंग, ली मेंगशी, जू शा, और अन्य।अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के साथ संयुक्त स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन द्वारा छोटे बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि की स्थापना। चीनी जर्नल ऑफ बायोलॉजिकल, 2022, 35(9): 1096-1101। डीओआई: 10.13200/जे.सीएनकी.सीजेबी.003713।